石理兰 张琳 赵桂珍 乔光彦  110004 沈阳，中国医科大学第二临床学院感染科
 

[摘要]
     丙型肝炎病毒（HCV）基因组具有高度的变异性，在机体内以准种的形式存在[1，2]，尤其以E2/NS1区384～410和474～480位氨基酸变异程度最高，分别称为HVR1和HVR2。近年的研究发现，HCV准种感染除与引起HCV感染慢性化有关外，还与HCV对干扰素（IFN）治疗的抵抗作用关系密切。本研究采用克隆测序法对10例应用IFN治疗的1b型慢性丙型肝炎患者进行了HVR1和HVR2准种异质性检测，以探讨HCV准种感染与IFN疗效的关系。
    1. 材料与方法：应用IFN治疗的1b型慢性丙型肝炎患者10例，男7例，女3例，年龄30～45岁。IFN治疗方案：IFNα （瑞士罗氏公司）3MU，3次/周肌肉注射，共24周。疗效判定：治疗结束时，丙氨酸氨基转移酶正常、HCV RNA阴转并持续至6个月以上为完全应答，否则为无应答。留取治疗前血清，-70℃冻存备用。E2/NS1基因片断扩增：用逆转录聚合酶链反应法（PCR）。引物序列如下：外引物1：5′-CTA CTCCGGATCCCACAAGC-3′（1009～1028nt）；外引物2：5′-GGGCTCGGAGTGAAGCAATA-3′（1519～1538nt）。内引物1：5′- ATTCCATGGTGGGGAACTGG-3′（1085～1104nt）；内引物2：5′-GCAATACACTGGACCACACA-3′（1504～1523nt）。具体方法见文献[3]。E2/NS1区准种异质性检测：采用克隆测序法。PCR产物纯化：按试剂盒（美国Qiagen公司产品）说明书进行。重组质粒的构建、转化与鉴定：按照PCR产物克隆试剂盒（美国Qiagen公司产品）说明书，将已纯化的PCR产物与载体质粒pDrive无性繁殖载体连接后，转化至感受态大肠杆菌EZ Competent细胞，经LB琼脂培养皿培养筛选出阳性菌落，分别挑取单个菌落接种于2ml LB培养基中扩增培养。碱裂解法提取重组质粒。应用酶切法进行鉴定。重组质粒的核苷酸序列测定由上海联合基因公司完成。结果应用Bioedit软件进行分析。
    2. 结果：E2/NS1区扩增电泳片断大小为388bp。克隆测序结果：10例患者中4例为完全应答者、6例为无应答者。每份血清挑取10个阳性克隆，共获得了93个克隆的序列。HVR1区准种的复杂性（准种数）无效组明显高于有效组（32对7，t＝2.602，P<0.05），HVR2区差异则无统计学意义 (11对6，t＝0.967，P>0.05）。HVR1区平均每个基因位点的核苷酸及氨基酸变异率无效组亦均明显高于有效组（3.56×10-2 对1.15×10-2，7.63×10-2对4.16×10-2，t值分别为7.832和8.065，P值均<0.01)，HVR2区有效组和无效组差异均无统计学意义。
    3. 讨论：研究表明，除HCV基因型、HCV RNA含量外，HCV准种的异质性也是影响IFN疗效的重要因素之一，有研究认为慢性丙型肝炎患者HCV HVR1区准种异质性程度越高，对IFN无应答的可能性越大[1]。但也有不同的研究则认为，HVR1准种异质性程度与病毒清除无关，在对IFN治疗的反应上，宿主因素可能起更重要作用[4]。本研究对1b型患者E2/NS1区中HVR1及HVR2准种的异质性（包括准种的复杂性与基因的差异性）与IFN疗效关系的检测结果表明，IFN治疗无应答组HVR1区准种的异质性程度明显高于应答组，而HVR2区准种的异质性程度在两组之间差异无统计学意义。说明HVR1区准种的异质性程度越高对IFN治疗无应答的可能性越大，可以对IFN治疗进行疗效预测，而HVR2区则不能。治疗前HVR1准种异质性程度高的患者对IFN应答率低，表明其体内可能存在耐IFN的病毒株，其确切机制尚不清楚，可能与机体的免疫压力选择作用有关。HVR1区为机体的免疫应答部位，IFN治疗在提高机体抗病毒的免疫效应的同时也使对HVR1的免疫压力增加，促使更多的变异发生，当IFN敏感株的复制被抑制后，适应新环境的变异株将成为优势株，此即压力选择作用。对IFN治疗无应答患者血清中存在大量的HCV变异株，IFN治疗使其中的敏感株复制水平迅速被抑制，适应新环境的变异株则被选择为优势株，表现为对IFN治疗抵抗，即无应答。
参  考  文  献
1Hino K, Yamaguchi Y, Fujiwara D, et al. Hepatitis C virus quasispecies and response to interferon therapy in patients with chronic hepatitis C: a prospective study. J Viral Hepat, 2000, 7: 36-42.

2Ambrosch A, Konig W. Characteristics of the hepatitis C virus and viral predictors of therapeutic response. Med Klin, 1999, 94: 626-632.

3Zhang L, Zhao GZ, Li Y, et al. Dynamic changes of HVR1 quasispecies in chronic hepatitis C after IFN therapy. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 2003, 11: 182-184.
张琳, 赵桂珍, 李颖, 等. 慢性丙型肝炎患者干扰素治疗前后HCV HVR1准种的动态变化. 世界华人消化杂志, 2003, 11: 182-184.

4Sandres K, Dubois M, Pasquier C, et al. Genetic heterogeneity of hypervariable region 1 of the hepatitis C virus (HCV) genome and sensitivity of HCV to alpha interferon therapy. J Virol, 2000, 74: 661-668.

基金项目：辽宁省教育厅资助（202013120）