贾鑫明,高平挥,曹永兵,姜远英*
(第二军医大学药学院药理学教研室,上海200433)

    [摘要]　ABC转运蛋白(ATP-bindingcassettetransporter,ABCT)属于膜转运蛋
白,存在于哺乳动物、细菌、真菌等多种细胞中,且与多种细胞的多药耐药(multid
rugresistance,MDR)有关。白念珠菌(Candidaalbicans)含有多种ABCT,但只有Cdr
1p、Cdr2p与MDR有关;另外,Cdr1p、Cdr2p具有外排泵、磷脂易位等功能。本文对白
念珠菌耐药蛋白的研究进展作一综述。

    由于器官移植患者大量使用免疫抑制剂,癌症患者长期接受放疗、化疗,广谱抗
生素的滥用和艾滋病的广泛传播,免疫功能低下者人数不断增多,真菌感染发生率逐
年增加,尤其是白念珠菌(Candidaalbicans)的感染最常见。氟康唑等药物常用于治
疗白念珠菌感染,但随着药物的长期使用,耐药现象越来越普遍。白念珠菌主要耐药
机制包括细胞对药物的外排能力不断增强、药物作用靶点基因突变或高度表达。其
中,白念珠菌的药物外排能力增强导致胞内药物浓度降低,是白念珠菌最重要的耐药
机制[1]。

    目前已知与白念珠菌药物外排有关的跨膜转运蛋白有2类:一类是易化载体超家
族蛋白(majorfacilitatorsuper-family,MFS)。Mdr1p是目前发现的惟一与白念珠
菌耐药性有关的MFS。另一类是含ATP结合区的转运蛋白,即ABC转运蛋白(ATP-bind
ingcassettetransporters,ABCT),在白念珠菌中的这类转运蛋白统称为白念珠菌耐
药蛋白(Can-didaalbicansdrugresistantprotein,Cdrp)。

    ABCT能够以主动转运方式跨膜转运多种分子,存在于哺乳动物、细菌、真菌等
细胞中,与细胞的多药耐药(mul-tidrugresistance,MDR)有关。哺乳动物细胞中,与
MDR有关的ABCT有P-糖蛋白(P-glycoproteins,P-gp)和多药耐药相关蛋白(multidr
ugresistanceassociatedprotein,Mrp)。酿酒酵母中约有30种ABCT,已知与酿酒酵
母多效耐药(pleitotropicdrugresistance,PDR)有关的ABCT包括Pdr5p、Snq2p(sa
ccharomycescerevisiae4-nitroquinoline-N-oxideresistance2protein)、Ycf1p
(yeastcadmiumfactor1protein)和Yor1p(yeastoligomycinresistance1protein),
其中,Pdr5p、Snq2p与P-gp同源,Ycf1p、Yor1p与Mrp同源。白念珠菌中约有10种AB
CT,但只有Cdr1p和Cdr2p与MDR有关[2]。

1　CDR1和CDR2基因序列分析

     CDR1(Candidaalbicansdrugresistance1)和CDR2(Candidaalbicansdrugresi
stance2)基因都位于白念珠菌3号染色体上,开放阅读框(openingreadingframe,OR
F)分别为4503bp和4500bp。CDR1和CDR2基因高度同源,4%相同,91%相似;CDR1和酿酒
酵母PDR5、SNQ2基因高度同源,分别有56%和42%相同,73%和66%相似[3,4]。虽然CD
R1和CDR2基因高度同源,但两者引起白念珠菌耐药的机制及其调控机制可能不同。
野生型白念珠菌中,CDR1低表达而CDR2不表达;CDR2单独表达不能改变白念珠菌表型
,但CDR2和CDR1同时表达比CDR1单独表达引起的白念珠菌耐药性更高[4]。

2　CDR1和CDR2基因的调控机制

     白念珠菌的CDR1和CDR2基因和酿酒酵母PDR5基因具有高度的同源性,暗示三者
的调控机制可能相同。已知酿酒酵母中PDR5基因的调控因子是锌指转录因子Pdr1p
和Pdr3p。白念珠菌中有3个与PDR1、PDR3同源基因,即FCR1～3(fluconuzoleresis
tance1-3)[5],只有FCR1含有与PDR1、PDR3相同的锌指转录基序。研究证明,Fcr1p
是白念珠菌MDR的负调控因子,但它与Cdr1p、Cdr2p的关系有待进一步研究。Puri等
[6]研究发现CDR1基因启动子区域含有多个调控元件,包括AP-1(activeprotein-1)
、YAP-1(yeastAP-1);另外,还有4个上游激活序列(upstreamactivatingse-quence
,UAS)和4个上游阻抑序列(upstreamrepressingse-quence,URS)。突变分析证明:氟
康唑、β-雌二醇、氯化镉等药物的诱导表达受近端(-345/+1)调控元件调节,而咪
康唑的诱导表达受远端(-857/-1147)调控元件调节,且与AP-1位点有关。Micheli等
[5]研究发现CDR1基因启动子区域含有3个调控元件,即1个基础表达元件(basalexp
ressionelement,BEE)和2个药物效应元件(drugresponsiveelement,DRE) a和DRE 
b;CDR2基因启动子区域含有1个调控元件DRE 。进一步研究发现,BEE和DRE b不是独
立调控元件,必须依赖DRE a发挥调控作用;DRE a和DRE 是CDR1和CDR2基因的反式调
控元件,而且这种调控作用没有菌株特异性和药物特异性,即在野生型和耐药型白念
珠菌中调控作用相同,不同药物如β-雌二醇、特比萘芬的诱导表达作用相同。酿酒
酵母PDR5基因启动子区域也存在药物效应元件,称多效药物效应元件(pleiotropic
drug-responsiveele-ment,PDRE),PDRE是锌指转录因子Pdr1p、Pdr3p作用的靶序列
。白念珠菌CDR1和CDR2基因的DREs与PDRE有差异,表现为CDR1和CDR2基因受药物诱
导后表达水平短暂增高,而PDR5基因没有药物诱导表达现象[5]。

3　Cdr1p和Cdr2p的结构和功能

    Cdr1p和Cdr2p都属ABCT。ABCT通常由4个结构域组成:2个跨膜区域(membrane-
spanningdomains,MSD)和2个核结合区域(nucleotidebindingdomains,NBD)。每个
MSD有6或7个跨膜片段,ABCT通过NBD的ATP结合盒(ATPbindingcassette,ABC)结合A
TP,ABC含有4个保守区域:WalkerA、B区域、信号域和中心域[2]。

    Cdr1p相对分子质量大小为169900,具有ABCT的典型特征。Cdr1p由2条同源半链
组成,每条半链包括N端亲水区域和C端疏水区域,后者有6个跨膜片段,前者含有ABC
的4个保守区域[3]。Cdr1p与酿酒酵母Pdr5p具有高度同源性:(1)都具有ABCT的典型
结构;(2)NBD的WalkerA区域都是半胱氨酸取代亮氨酸;(3)ABC的C端都没有典型的信
号域。但Cdr1p与Pdr5p也有功能差异:(1)CDR1单拷贝或低拷贝就可以导致白念珠菌
耐药,而PDR5多拷贝才能引起酿酒酵母耐药;(2)CDR1和PDR5具有耐药特异性,如CDR
1可以导致白念珠菌对寡霉素耐药,而PDR5却不能导致酿酒酵母对寡霉素的耐药。

    Cdr2p相对分子质量大小为168000,与Cdr1p一样,也具有ABCT的典型特征[4]。
Cdr2p和Cdr1p的N端和C端都具有多样性,导致两者功能差异,表现为Cdr1p能特异性
引起白念珠菌对磺胺米隆耐药,而Cdr2p能特异性引起白念珠菌对甲紫耐药。总体来
说,Cdr2p功能较Cdr1p弱,这种差异是否由于氨基酸置换引起有待进一步研究(CDR2
与CDR1不同,含有3个CUG密码子,在白念珠菌中翻译为丝氨酸而在酿酒酵母中翻译为
亮氨酸)。

3.1　Cdr1p和Cdr2p的外排泵作用

  　ABCT的主要功能是能量依赖型外排各种细胞毒性药物。Cdr1p和Cdr2p对各种药
物都具有外排功能,包括:(1)唑类抗真菌药氟康唑、酮康唑、咪康唑、伊曲康唑;(
2)其他类抗真菌药磺胺米隆、特比萘芬、阿莫罗芬、氟乃静;(3)代谢抑制剂环己亚
胺、布雷菲德菌素A、诺考达唑、变蓝菌素、氯霉素、邻二氮杂菲、甲紫;(4)荧光
染料罗丹明123、罗丹明6G、二乙酰基荧光素(fluoresceindiacetate,FDA);(5)人
类固醇类激素β-雌二醇、皮质甾酮、麦角固醇、地塞米松[3,4,7,8]。膜流动性影
响Cdr1p的外排泵功能,当膜流动性增加时,Cdr1p外排罗丹明123、β-雌二醇、氟康
唑能力下降[9]。明确外排泵Cdr1p和Cdr2p作用底物有助于我们研究白念珠菌的MD
R机制,阐明药物相互作用的竞争机制。某些荧光染料可以作为白念珠菌MDR指示剂
。

3.2　Cdr1p和Cdr2p的磷脂易位作用

   　膜磷脂在多数细胞膜中都是不对称分布,磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸分布在
双层膜内部,磷脂酰胆碱、鞘磷脂分布在双层膜外部[10]。细胞膜的不对称性对于
细胞的正常生理过程具有重要作用,如激活促凝血活性和诱导细胞凋亡等。哺乳动
物细胞ABCTP-gp介导磷脂易位维持细胞膜的不对称性。酿酒酵母中,细胞膜的不对
称性与氨基磷脂有关,受能量依赖型的氨基磷脂易位酶调控;而磷脂酰乙醇胺的易位
受锌指转录因子Pdr1p和Pdr3p调控。白念珠菌中,Cdr1p和Cdr2p是磷脂易位子,介导
磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱由细胞膜的内部向外部分布,维持白念
珠菌细胞膜的不对称性。另外,氟康唑等Cdr1p作用底物可以抑制膜磷脂的不对称分
布,可能是因为Cdr1p作用底物和膜磷脂与Cdr1p的结合位点相同[10,11]。

    白念珠菌膜磷脂不对称分布的功能尚未明确。有报道[9,10]称膜磷脂的不对称
分布能够影响白念珠菌的表型多样化和应激信号的传递,对某些基因的转录活性也
具有重要的调控作用。总之,细胞膜的不对称性及其维持对于致病酵母菌具有重要
意义。

    ABCT介导的MDR广泛存在于哺乳动物、细菌、真菌等多种细胞中,因而研究其结
构、功能及其调控机制,对于阐明细胞的MDR机制具有重要意义,对于开发新药也具
有重要的指导作用。目前研究发现免疫抑制剂他克莫司(tacrolimus)与伊曲康唑合
用具有协同效应,能够增强伊曲康唑的抗真菌活性,这也为进一步开发抗菌增强剂提
供了广阔的前景[12]。另外,还可以开发外排泵抑制剂阻断ABCT的外排功能,增加细
胞内药物累积,从而增强抗真菌药的抗真菌活性。

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     第二军医大学学报